BWYTA. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Dangoswyd yn ddiweddar bod y ffwng ascomycete Ilyonectria crassa yn gallu heintio cloron tatws. Y gwaith hwn yw'r cyntaf i ddadansoddi nodweddion biolegol a gwrthiant i rai ffwngladdiadau o'r straen I. crassa sydd wedi'u hynysu oddi wrth datws. Roedd dilyniannau rhanbarthau rhywogaethau-benodol y straen “tatws” yn cyd-daro â'r rhai a gafwyd yn gynharach ar gyfer ffyngau wedi'u hynysu o wreiddiau narcissus, ginseng, aethnenni a ffawydd, bylbiau lili a dail tiwlip. Yn ôl pob tebyg, gall llawer o blanhigion gwyllt a gardd fod yn gronfeydd wrth gefn o I. crassa. Ymchwiliodd y tafelli tatws a thatws wedi'u heintio â straen, ond ni wnaethant heintio'r ffrwythau tomato cyfan a'r gloron tatws yn gyfan. Mae hyn yn dangos bod I. crassa yn barasit clwyf. Dangosodd gwerthusiad o wrthwynebiad i fludioxonil, difenoconazole ac azoxystrobin ar gyfrwng maetholion effeithiolrwydd uchel y cyffuriau hyn.
Roedd dangosydd EC50 (crynodiad y ffwngladdiad, sy'n arafu 2 gwaith cyfradd twf radial y nythfa o'i gymharu â'r rheolaeth nad yw'n ffwngladdiad) yn hafal i 0.4; 7.4 a 4 mg / l, yn y drefn honno. Dylid ystyried y posibilrwydd o ddatblygiad y clefyd a achosir gan I. crassa wrth asesu ffytopatholegol o gloron tatws a datblygu mesurau amddiffyn planhigion.
Mae datblygu micro-organebau ffytopathogenig yn arwain at golledion uchel ar bob cam o dyfu a storio tatws. Wrth gynllunio mesurau amddiffynnol, fel rheol, mae pathogenau adnabyddus yn cael eu hystyried, megis rhywogaethau'r genera Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, ac ati. Fodd bynnag, yn ystod y blynyddoedd diwethaf, mae mwy a mwy o adroddiadau wedi ymddangos am ymddangosiad micro-organebau ffytopathogenig newydd ar datws. Nid yw eu bioleg wedi'i hastudio'n wael, nid yw effeithiolrwydd ffwngladdiadau a ddefnyddir ar datws mewn perthynas â hwy yn hysbys, ni ddatblygwyd dulliau diagnostig. Gyda datblygiad màs, gallant achosi niwed sylweddol i'r cnwd tatws. Un o'r micro-organebau hyn yw'r ffwng ascomycete Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, a ddarganfuwyd gyntaf gan yr awduron ar gloron tatws (Chudinova et al., 2019).
Mae'r gwaith hwn yn cyflwyno canlyniadau'r dadansoddiad o'r straen I. crassa sydd wedi'u hynysu oddi wrth gloron tatws. Astudiwyd morffoleg cytrefi a strwythurau mycelial I. crassa, dilyniannau niwcleotid o ranbarthau DNA rhywogaeth-benodol, ffyrnigrwydd tatws a thomatos, a gwrthiant i rai ffwngladdiadau poblogaidd.
Deunyddiau a dulliau
Fe ddefnyddion ni'r straen I. crassa 18KSuPT2 wedi'i ynysu yn 2018 o'r gloron tatws heintiedig a dyfwyd yn rhanbarth Kostroma. Effeithiwyd ar y cloron gan fath pydredd sych gyda cheudod wedi'i orchuddio â myceliwm brown golau. Gan ddefnyddio nodwydd dyrannu di-haint, trosglwyddwyd y myceliwm ffwngaidd i ddysgl Petri gyda chyfrwng agar (wort cwrw 10%, agar 1.5%, penisilin 1000 U / ml). Deorwyd y platiau yn y tywyllwch ar 24 ° C.
Defnyddiwyd microsgop ysgafn Leica DM2500 gyda chamera digidol ICC50 HD a microsgop binocwlar Leica M80 gyda chamera digidol IC80HD (Leica Microsystems, yr Almaen) i dynnu llun, asesu maint a morffoleg sborau ac organau sborau.
Er mwyn ynysu DNA, tyfwyd y myceliwm ffwngaidd mewn cyfrwng pys hylif, yna ei rewi mewn nitrogen hylif, ei homogeneiddio, ei ddeor mewn byffer CTAB, ei buro â chlorofform, a'i olchi ddwywaith â 2% o alcohol.
Disgrifir y dull echdynnu DNA yn fanwl yn yr erthygl gan Kutuzova et al. (2017).
Er mwyn pennu'r rhywogaeth trwy ddulliau moleciwlaidd a chymharu â straenau I. crassa hysbys eraill, cynhaliwyd PCR gyda phreimio gan ganiatáu ymhelaethu ar ranbarthau DNA rhywogaeth-benodol: ITS1-5,8S-ITS2 (primers ITS5 / ITS4, White et al., 1990), rhanbarthau genynnau b -tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) a ffactor elongation cyfieithu 1α (tef1α) (primers EF1-728F / EF1-986R, Carbone a Kohn, 1999). Tynnwyd ampliconau o'r hyd a ddymunir o'r gel gan ddefnyddio'r pecyn Evrogen CleanUp. Dilynwyd y rhanbarthau chwyddedig gan ddefnyddio Pecyn Dilyniannu Beicio Terminator v3.1 BigDye® (Biosystems Cymhwysol, CA, UDA) ar ddilyniant awtomataidd Biosystems Cymhwysol 3730 xl (Biosystems Cymhwysol, CA, UDA). Defnyddiwyd y dilyniannau niwcleotid a gafwyd i chwilio am ornest yng nghronfa ddata GenBank Canolfan Genedlaethol Gwybodaeth Biotechnoleg yr Unol Daleithiau (NCBI). Perfformiwyd dadansoddiad ffylogenetig gan ddefnyddio rhaglen MEGA 6 (Tamura et al., 2013).
Penderfynwyd ar ffyrnigrwydd ar ffrwythau gwyrdd cyfan tomato ffrio mawr (amrywiaeth Dubrava) a chloron tatws (amrywiaeth Gala). Yn ogystal, i efelychu difrod i ffrwythau a chloron wedi'u difrodi, gwnaethom ddefnyddio tafelli o'r un ffrwythau a chloron. Gosodwyd tafelli o gloron mewn siambrau llaith, a oedd yn seigiau Petri gyda phapur hidlo gwlyb ar y gwaelod. Gosodwyd sleid ar y papur, lle gosodwyd tafelli o gloron neu ffrwythau arno yn ei dro. Rhoddwyd cloron a ffrwythau cyfan hefyd mewn cynwysyddion gyda phapur hidlo gwlyb ar y gwaelod. Yng nghanol y dafell (neu ar wyneb cyfan y cloron neu'r ffrwyth), gosodwyd darn o agar (5 × 5 mm) gyda hyffa ffwngaidd ar ôl 5 diwrnod o dyfu ar agar wort.
Cynhaliwyd yr asesiad o wrthwynebiad straen ffwngaidd i ffwngladdiadau mewn amodau labordy ar gyfrwng maetholion agar. Gwnaethom astudio tueddiad i gyffuriau ffwngladdol Maxim, KS (cynhwysyn gweithredol fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenoconazole 250 g / l) (Catalog y wladwriaeth ..., 2020). Gwnaed gwerthusiad mewn prydau Petri ar gyfrwng wort-agar trwy ychwanegu'r cyffuriau a astudiwyd mewn crynodiadau o'r sylwedd actif 0.1; un; 1 ppm (mg / L) (ar gyfer fludioxonil a difenoconazole), 10; deg; 1 ppm (ar gyfer azoxystrobin) ac yn y cyfryngau heb ffwngladdiad (rheolaeth). Ychwanegwyd y ffwngladdiad at y cyfrwng wedi'i doddi a'i oeri i gyfrwng 10 ° C, ac ar ôl hynny arllwyswyd y cyfrwng i seigiau Petri. Gosodwyd bloc agar gyda myceliwm ffwngaidd yng nghanol dysgl Petri a'i ddiwyllio ar dymheredd o 100 ° C yn y tywyllwch. Ar ôl 60 diwrnod o ddeori, mesurwyd diamedrau'r cytrefi i ddau gyfeiriad cyd-berpendicwlar; cyfartaleddwyd y canlyniadau mesur ar gyfer pob cytref. Perfformiwyd yr arbrofion yn driphlyg. Yn seiliedig ar ganlyniadau'r dadansoddiadau, cyfrifwyd yr EC24, sy'n hafal i grynodiad y ffwngladdiad, a hanerodd gyfradd twf radial y Wladfa o'i gymharu â'r rheolaeth ffwngladdol.
Canlyniadau a thrafodaeth
Ar seigiau petri gydag agar wort, roedd y ffwng yn ffurfio cytrefi â myceliwm gwyn flocculent. Trodd y cyfrwng o dan y myseliwm yn frown-frown. Pan fydd y cyfrwng yn sychu, ffurfiodd y ffwng sborau o ddau fath ar conidiophores sengl ac agregedig mewn sporodochia bach. Mae macroconidia yn hirgul, silindrog, gydag un i dri septa, hyd cyfartalog 27.2 µm gydag ystod o werthoedd o 23.2 i 32.2 µm, lled - hyd at 4.9 µm (Ffig. 1). Hyd cyfartalog microconidia yw 14.3 µm gydag ystod o werthoedd o 10.3 i 18.1 µm, mae'r lled hyd at 4.0 µm. Mae'r holl gymeriadau macro- a micromorffolegol yn ffitio i ystod amrywiad y rhywogaeth Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Roedd dilyniannau rhanbarthau DNA rhywogaeth-benodol (ITS, b-tubulin, TEF 1α) yn cyd-fynd yn llwyr â dilyniannau'r straenau I. crassa a astudiwyd gennym yn gynharach (Chudinova et al., 2019, Tabl 1). Er mwyn astudio mynychder I. crassa mewn rhanbarthau eraill a dadansoddi sbectrwm y diwylliannau yr effeithiwyd arnynt, dadansoddwyd dilyniannau DNA tebyg yng nghronfa ddata GenBank (Tabl 1). Y gorgyffwrdd oedd 86 i 100%. Roedd dilyniannau pob un o'r tri rhanbarth DNA o'r straen “tatws” I. crassa yn union yr un fath â dilyniannau'r straen sydd wedi'u hynysu oddi wrth y bwlb lili a gwreiddiau narcissus yn yr Iseldiroedd ac o'r gwreiddyn ginseng yng Nghanada. Methwyd â dod o hyd i straenau crassa I. eraill gyda thri dilyniant tebyg wedi'u dadansoddi mewn cronfeydd data agored. Fodd bynnag, dangosodd dadansoddiad o'r dilyniannau ITS a b-tubulin a adneuwyd bresenoldeb I. crassa ar ddail tiwlip yn y DU. Nodwyd ffyngau â dilyniant ITS tebyg wrth ddadansoddi mycobiota gwreiddiau aethnenni yng Nghanada a gwreiddiau ffawydd yn yr Eidal, a chloron tatws yn Saudi Arabia (Tabl 1). Mae canlyniadau'r astudiaeth hon yn dangos bod gan I. crassa ddosbarthiad byd-eang a'i fod yn gallu heintio amrywiol rywogaethau planhigion.
Wrth bennu'r pathogenigrwydd ar dafelli o domatos a thatws ar y 5ed diwrnod, cyrhaeddodd diamedr y briw 1.5 cm. Nid oedd y straen yr ymchwiliwyd iddo yn heintio'r ffrwythau tomato cyfan a'r gloron tatws gyfan. Fodd bynnag, effeithiwyd ar y sepalau ar y tomato. Er mwyn eithrio'r posibilrwydd o halogiad, ynyswyd ffwngaidd o'r myceliwm a ddatblygwyd ar dafell cloron tatws i ddiwylliant pur. Roedd yn hollol union yr un fath â'r straen rhieni. Yn ôl pob tebyg, mae I. crassa yn barasit clwyf.
Mae cyn-blannu cloron hadau gyda ffwngladdiadau yn lleihau datblygiad afiechydon ar blanhigion yn ystod y tymor tyfu. Ar gyfer dewis ffwngladdiadau effeithiol, mae'n bwysig asesu pa un ohonynt sy'n effeithiol yn erbyn I. сrassa. Astudiodd y gwaith sylweddau actif eang o ffwngladdiadau - fludioxonil, azoxystrobin, difenoconazole. Mae ffludocsonil wedi'i gynnwys mewn sawl cymysgedd a ddefnyddir i wisgo hadau a chloron hadau cyn plannu. Defnyddir Fludioxonil (Maxim) hefyd i drin cloron hadau cyn eu storio. Mae Difenoconazole ac azoxystrobin hefyd wedi'u cynnwys mewn nifer o baratoadau a ddefnyddir i brosesu deunydd hadau, yn ogystal ag mewn paratoadau sydd wedi'u bwriadu ar gyfer prosesu planhigion llystyfol (catalog y Wladwriaeth ..., 2020).
Astudiwyd cyfradd twf I. crassa ar gyfryngau (Ffig. 2) gyda chrynodiadau gwahanol o sylweddau actif: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobin (EC50 = 4 ppm), a difenoconazole (EC50 = 7.4 ppm) (Tabl 2). Gellir ystyried y paratoadau hyn yn hynod effeithiol yn erbyn I. crassa, gan fod eu EC50 yn sylweddol is na'r crynodiad argymelledig o'r paratoad yn yr hylif gweithio a ddefnyddir i drin cloron. Yn ôl Catalog y Wladwriaeth ... (2020), mae crynodiad fludioxonil yn yr hylif ar gyfer trin cloron tatws rhwng 500 a 1000 ppm, azoxystrobin (yn yr hylif ar gyfer trin gwaelod y rhych) - 3750-9375 ppm, difenoconazole (yn yr hylif ar gyfer trin planhigion llystyfol) - 187.5– 625 ppm.
Tabl 1. Dilyniant tebygrwydd dilyniannau straen-benodol 18KSuPT2 ac Ilyonectria crassa sydd ar gael yng nghronfa ddata Genbank
Straen | Planhigyn cynnal, safle ysgarthiad | Rhifau dilyniant a adneuwyd yn GenBank, canran y tebygrwydd | Cyswllt | ||
ITS | β-tubulin | TEF 1α | |||
17KSPT1 a 18KSuPT2 | Cloron tatws, rhanbarth Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, y gwaith hwn |
CBS 158/31 | Gwreiddiau Narcissus, Yr Iseldiroedd | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Bwlb Lily, Yr Iseldiroedd | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Gwreiddyn Ginseng, Canada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Deilen tiwlip, DU | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Gwreiddiau cribog, Canada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Ffawydd, yr Eidal | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Cyflwyniad uniongyrchol |
KAUF19 | Cloron tatws, Saudi Arabia | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = heb ei adneuo
Tabl 2. Ymwrthedd Ilyonectria crassa i ffwngladdiadau
(sylwedd gweithredol) | EC50, tt | ||||
diwrnod 3 | diwrnod 5 | diwrnod 7 | |||
Rheoli | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenoconazole) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
Yn ein gwaith, roedd straenau I. crassa wedi'u hynysu oddi wrth gloron tatws yn rhanbarthau Kostroma a Moscow (Chudinova et al., 2019). Datgelwyd cyfran uchel o straen ffwngaidd gyda dilyniannau ITS yn union yr un fath ag I. crassa wrth ddadansoddi mycobiota cloron tatws yn Saudi Arabia (Gashgari a Gherbawy, 2013). Yn ôl pob tebyg, nid yw I. crassa mor brin ar datws ag y gallai ymddangos. Dangosodd ein harbrofion y gallai'r ffwng heintio ffrwythau tomato wedi'u difrodi. Mae'n hysbys o'r llenyddiaeth fod I. crassa yn gallu datblygu'n saprotroffig yn y pridd (Moll et al., 2016), yn ogystal ag effeithio ar amrywiaeth o blanhigion, hyd yn oed rhai pell yn dacsonomaidd fel cennin Pedr, lilïau, ginseng, aethnenni a ffawydd (Tabl 1). un). Yn ôl pob tebyg, gall llawer o blanhigion gwyllt a gardd fod yn gronfeydd wrth gefn o I. crassa. Mae'r uchod yn dangos, wrth ddatblygu mesurau amddiffyn, bod angen ystyried y posibilrwydd o effeithio ar gloron tatws gyda'r ffwng hwn. Mae paratoadau eang ar gyfer trin cloron tatws sy'n cynnwys fludioxonil, azoxystrobin a difenoconazole wedi dangos effeithiolrwydd ffwngladdol uchel yn erbyn I. crassa.
Cefnogwyd y gwaith hwn gan Sefydliad Ymchwil Sylfaenol Rwsia (Grant Rhif 20-016-00139).
Cyhoeddwyd yr erthygl yn y cyfnodolyn "Plant Protection Bulletin", 2020, 103 (3)